À 17 ans, Jolene Blalock entame une carrière de mannequin en Europe et en Asie. En 1998, elle débute sa carrière d'actrice dans un épisode de la sitcom Les Dessous de Veronica. Elle apparaîtra par la suite dans le téléfilm Jason et les Argonautes (2000) et des séries comme La croisière s'amuse, nouvelle vague (1999), Les Experts (2000), JAG (2001)... En 2001, elle accepte le rôle principal de T'Pol dans la série Star Trek : Enterprise, qu'elle incarne dans les 98 épisodes de la série jusqu'à l'annulation prononcée en 2005.

Elle a également participé à la franchise Stargate en incarnant Ishta dans deux épisodes de Stargate SG-1 en 2003-2004. Il était prévu qu'elle joue un ancien amour de Sawyer durant la saison 2005-2006 de Lost, les disparus, mais l'épisode fut finalement recentré sur Michael. En 2008, elle joue dans Starship Troopers 3 : Marauder.