Elle a été élevée dans les milieux artistiques parisiens, sa mère travaillant dans le monde du cinéma. A 17 ans, avec son bac en poche, elle part à Londres pour faire l'Actor's Sudio. Elle étudie ensuite l'histoire de l'art et la psychologie à la fac. Elle prend également des cours de danse, de théâtre, de cirque et de chant. Puis, elle laisse tout tomber et gagne sa vie en tant que vendeuse de vêtements et serveuse dans une boîte de nuit. Elle débute au cinéma en faisant de la figuration sur le tournage de "Bleu" de Kieslowski en 1992, puis dans "L'histoire du garçon qui voulait qu'on l'embrasse" l'année suivante. En 1995, elle rencontre Agnès Varda sur le plateau du Cercle de Minuit. La réalisatrice l'engage une semaine plus tard pour tenir le rôle principal des "Cent et une nuits".

Elle y interprète une jeune journaliste aux côtés de Marcello Mastroianni et de Michel Piccoli. Même si le film est un échec public, Julie Gayet ne quittera plus l'écran par la suite. Après avoir joué dans des comédies, "Delphine:1 - Yvan: 0", "Les deux papas et la maman" et "Pourquoi pas moi ?", elle délaisse finalement son image de jolie fille souriante et enchaîne à bon rythme les films d'auteur à la sortie plus ou moins confidentielle. En 1996, elle obtient le Prix de la Meilleure comédienne au Festival de cinéma des premières oeuvres à Québec pour le très sordide "Sélect Hôtel" de Laurent Bouhnik. Pour ce même film, elle remporte en 1997 le Prix Romy-Schneider et celui de Meilleure actrice européenne à Bruxelles. En 2004, elle a joué dans quatre films dans le très remarqué "Clara et moi" d'Arnaud Viard.